液相色譜儀分析方法開發你學會了嗎？液相色譜儀是一種實驗室內用來分析數據的一種儀器，是一種高效且準確的分析方法，而分析方法在不同的行業中就有不同的要求，部分行業對質量控制有很高的要求，液相色譜儀分析方法是質量控制的重要手段，那么液相色譜儀分析方法開發你學會了嗎？接下來和天恒儀器小編一起了解一下吧。

液相色譜主要有親水色譜、正相色譜、反相色譜、離子交換色譜、凝膠滲透色譜/體積排阻色譜等幾種色譜分離模式。其中反相色譜是到目前為止*通用的 HPLC 方法，大約占所有方法的 60%，將近 95% 的色譜工作者都在使用。那么本文我們主要來講反相色譜分析方法的開發。

反相色譜的原理：分析物與疏水固定相之間發生非極性、非特異性相互作用，即分析物在極性流動相和非極性固定相之間分配，與正相色譜相反。反相色譜柱通常使用的固定相有C18、C8苯基。反相色譜系統通常使用的流動相有:a. 水，可含緩沖液，或用酸或堿調節pH ， b . 可與水混溶的有機溶劑。

如何來開發一個合理可行的反相色譜分析方法，這其實是每一個色譜工作者必須面對并解決的問題。分析方法的開發其實主要是選擇合適的色譜柱、流動相、檢測波長來得到一個初步分析方法，后面再做其他方面的優化，使色譜峰之間的分離度、峰形、峰高、峰寬滿足要求。下面我們就來仔細講講反相色譜分析方法的開發。

一、色譜柱的選擇：

高效液相色譜分析中，色譜柱的選擇直接影響了分離效果的好壞，選擇合適的色譜柱可以縮短方法開發所需的時間，并且使方法更具穩定性。但是我們要清楚現在商品化的液相色譜柱比比皆是，根據色譜柱的參數可以給我們提供一個初步的選擇，但由于各個儀器廠商的填料技術和鍵合技術都有差異。即使都是C18柱，不同品牌、同一品牌不同系列都有不同的功能，有能耐受低pH值的、有耐高溫的、有適合堿性樣品的等等。那就要求我們要對各種類型的色譜柱做充分的了解之后，才能做出合適的選擇。

二、流動相的選擇

一般來說，反相LC 的流動相包括水和作為改性劑的乙腈或甲醇。改性劑還有四氫呋喃（THF）和異丙醇。反相色譜中流動相中水相的pH和離子強度在開發對條件微小變化不敏感的耐用方法中非常重要。對于離子型化合物，典型樣品的保留隨 pH 改變而明顯變化。在這類反相系統中，控制 pH 對于保留和選擇性的穩定非常重要。通常在 pH 2 到 4 條件下，保留時間對pH的微小改變穩定性*高，因此色譜工作者將這一pH范圍作為大多數樣品方法開發的起始pH，包括堿性化合物和一般的弱酸。

為了有較好的重現性，所用的 pH 應高于或低于待分離溶質pKa或pKb上下一個pH單位。如果不清楚分析物的pKa，建議大家測試一種以上流動相 pH 可提供*好結果。大多數反相柱都可以在pH 2-8條件下使用，這樣為分離選擇*佳流動相 pH 提供了較寬的范圍。流動相 pH 對色譜分離的影響有多種方式。根據所分析的化合物，pH可能影響選擇性、峰形和保留。如果是可離子化的化合物，如酸或堿，保留因子和選擇性隨 pH的改變變化非常明顯，如果是非極性較強或中性的化合物，pH 對分離度和保留的影響一般不明顯。

三、波長的選擇

做分析方法開發我們需要二極管陣列檢測器，選擇檢測波長和做色譜峰純度檢查，通過色譜 峰純度檢查來保證主峰里沒有掩蓋其它雜質，做純度檢測對波長選擇的要求比較簡單，原則 是把盡量多的雜質在色譜圖上體現出來。很多雜質只有在低波長下才有紫外吸收，所以我們 選擇盡可能低的波長，乙腈的截止波長在 190~195nm，用乙腈做流動相檢測波長可以選擇 在 210~220nm。也有公司要求分別選取產品紫外吸收*強的波段和 210~220nm 兩個波段做 對比，哪個純度低以哪個為準，這樣可以更嚴格的控制產品的質量。

四、分析方法的優化

01

改變梯度斜率

更緩的梯度斜率可以提高分離度，降低梯度斜率將降低靈敏度， 更陡的梯度斜率可能壓縮色譜峰，經常會導致分離度的降低， 增加梯度斜率將增加靈敏度， 改變梯度斜率時要平衡峰高與分離度的關系。

02

改變柱溫

溫度會影響色譜分析中的每一個化學過程，例如增加溫度會降低移動相的粘度，如果流動速度恒定將導致系統背壓降低，高溫將改變固定相和流動相之間的分配速率，然而由于提高了被測物分散性，會加快優化線性速度。對溫度變化敏感的化合物，溫度的微小變化都會導致選擇性發生獨特變化。在這里我們要注意選擇柱溫一要考慮色譜柱的承受范圍，二要考慮該溫度下，檢測成分是否會降解。

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綜上所述，大家對液相色譜儀分析方法開發你學會了嗎，有了一個了解，選擇一家有靠譜售后的實驗室儀器廠家也能幫大家解決很多儀器上的小問題，以上就是今天的全部內容了，如需了解更多請閱讀《氣相色譜儀應該怎么去操作呢？2022氣相色譜儀的操作指南分享》